实验服务

透射电镜样品取材方法及要求

一、透射电镜样品取材方法
（一）组织和器官取材方法：
事先准备好所需的器械和固定液，并把它放4℃冰箱内预冷备用。如为穿刺物（肾组织、肝组织、脾组织等）、剪取物（胃镜剪取物、支气管镜剪取物、肠镜剪取物等）、手术切除物（肿瘤组织以及实验动物脏器等），均应在离体后迅速用生理盐水冲洗后或直接投入预冷的2.5%戊二醛固定液（保质期为1个月）内，并把它放4℃冰箱内保存，一般要求在两分钟内完成。在处理手术切除物时，应事先准备好两把锋利的刀片（如剃须刀或手术刀）和蜡板，把固定液滴在蜡板上，再把切下来的脏器用手术刀切成小块，放在蜡板上的固定液中，接着用双刀片拉锯法在固定液中将组织切成约1立方毫米大小或横切面约1平方毫米的长条形，然后用牙签或镊子（轻轻夹住，禁止挤压）把组织移入装有固定液的小瓶内，瓶子建议用带螺纹密封的样本瓶，确保固定液不会溢出，固定液一定要加注到瓶子的九成满。如为肺组织，应在固定液中充分震荡，使其完全沉到瓶底为止。

（二）游离细胞取材法：
组织培养和游离细胞（如血细胞、脱落细胞以及细菌病毒等），常悬浮分散在介质中，首先必须将其凝集成团，然后进行固定，具体做法如下：
1、血浆凝集法：将抗凝全血离心分层（2000转/每分钟，10—20分钟），用毛细吸管沿着管壁轻轻的将上清夜吸取（不要破坏白细胞层），接着用吸管吸取固定液，并沿着管壁将2.5%戊二醛固定液慢慢地加入进行固定，然后把它放在4℃冰箱内保存。
2、血浆（血清）混合法：如为细菌、病毒、脱落细胞、培养细胞则先将它们制成悬液放置于离心管内（最好是玻璃的），离心成团（1000～3000转/分钟，10分钟，下同），去上清液后加入2.5%戊二醛固定10分钟左右，离心，再弃去多余的固定液，然后和少量抗凝血浆或血清混合均匀，离心成团，去上清液（留少许），用吸管吸取2.5%戊二醛固定液沿着离心管壁缓慢滴入，尽量避免团块分散，静置于4℃冰箱内保存备用。

二、取材要求
电镜生物样品制备的关键在于制出的样品必须忠实地反映其生活时的状态，尽量避免“死后改变”和人为假象的发生，因此，取材这一步非常重要。取材要求如下：
1、冷：取材的器械和固定液均应事先在4℃冰箱内预冷。
2、快：取材时动作要快，所用的刀片要锋利，一般要求在脏器离体后1—2分钟内取材完毕并放入2.5%戊二醛固定液内于4℃冰箱内保存。另外，应避免对组织的挤压和人为损伤。
3、小：为了能让组织充分固定，必须把组织切成尽可能小的块，一般要求组织块在1立方毫米左右或横切面为1平方毫米的长条形,长度一般不超过3毫米，而皮肤、肌腱等组织较致密，取材应在1立方毫米以内。
4、准：由于电镜标本要求小块取材，为了电镜观察的准确性，取材部位必须要准确，而且，不同实验组的标本尽量取在相同部位（如心肌组织取左心室，则一律取左心室），否则，将无法比较，进而影响观察结果，最终导致电镜观察失败。

三、各种组织取材方法：

脑组织取材法

在一般情况下，脑组织先进行灌注固定（4%多聚甲醛溶液），待固定完成后应马上打开颅骨，暴露出所要取材的位置，根据取材的要求以及实验目的割取相应的部位，如研究脑神经轴索、髓鞘以及神经胶质细胞，建议取材于脑组织白质部分，此处有髓神经纤维相对较多，胶质细胞比较丰富；如要研究神经元以及血脑屏障结构，建议取材于脑皮质的灰质部分，而且最好做定向包埋，以神经元长轴方向（大约为脑组织的矢状面）作为切面方向，这样可以很好地观察神经元细胞核、轴突以及树突结构的变化，突触以及毛细血管的结构也比较容易见到。

睾丸及附睾组织取材方法

由于睾丸组织比较松软，固定难度较大，目前大多采取灌注固定法进行固定，但此方法如果处理不当，很可能会造成固定不良，原因是睾丸的血供离心脏比较远，固定液难以到达，睾丸曲细精管基膜比较厚，固定液难以渗透，导致固定不良。从兄弟院校电镜室了解到，我们还可以采用注射固定法即用注射针直接插入睾丸内部，从多个方向进行注射固定液，然后割取观察部位进行进一步浸泡固定；另外一种方法就是直接割取观察部位进行浸泡固定，需要注意的是，取材的睾丸组织必须切的很细，让固定液直接渗透入曲细精管的断面，这样，各层生殖细胞都会得到很好的固定，不过比较麻烦的就是每次操作后都要离心处理。
另外需要注意的是，要观察生精细胞，必须取材于睾丸的睾丸网部位，如果取材于直精小管部位，就看不到生精细胞了，切切注意！大鼠与小鼠的睾丸网比较表浅，就在白膜下附近。如果要观察成熟精子，最好取材于附睾的尾部，此处精子已基本成熟，而且精子密度最高。

肺组织取材法

大家一定会觉得肺组织取材比较困难，因为肺组织内部气体无法彻底排放而导致组织悬浮于固定液表面，使得固定液不能及时渗透进组织内部而导致大部分组织固定不良或无法固定。目前提倡的还是主动脉灌注固定。如果条件不成熟，只能采取浸泡固定。组织取出后尽量切得小，同时利用震荡的方法将组织沉入固定液中，还有一种方法就是将组织放在载玻片上，并将固定液滴在其上，用另外一片载玻片轻轻压在上面并轻轻挤压，一压一松，可以看到固定液内有小气泡溢出，直到小气泡消失为止，但必须注意力度不能太大，否则，组织的细胞将会被破坏。
需要注意的是，在固定之前，取材者必须清楚自己的研究目的，从而采取相应部位进行取材。如果以研究支气管黏膜为主的（这里指肺内的支气管），尽量取材于靠近肺门部位，这里有具有软骨的大支气管，在肺叶的内侧1/2部分，有小支气管、细支气管以及终末细支气管；如果主要研究肺泡上皮细胞、终末细支气管、呼吸性细支气管以及肺泡隔的结构等，建议取材于肺叶靠近胸膜一侧或者肺尖部；如果研究肺动脉内皮或壁的结构，建议取材于肺门附近的肺叶组织，这里的大小动脉数量比较多，而远侧肺呼吸部的动脉极少。

肾组织取材法

肾外包被一层薄膜，主要由纤维组织和少量平滑肌组成。一般肾标本取材部位在肾实质，实质由皮质与髓质两部分组成，一般取材部位在肾皮质，皮质位于肾的外周，其厚度因动物种类不同而有差异，一般在1mm—4mm。肾组织除了采取灌注固定外，直接浸泡固定的效果也是比较满意。肾组织取材相对比较简单，一般临床上均采用穿刺术，然后根据需要切取皮质或髓质进行观察。动物肾组织取材要注意的是，一要取材位置选择在肾的上极，二要准确判定皮质与髓质的位置，如果是皮质部位，只要将包膜分离后，将肾最外层组织取下来即可，这里一般都会有肾小球存在。

动脉取材法

动脉遍布全身，直径大小不同，一般小动脉（直径小于１mm）切成长约2mm短柱状即可．如果是大动脉，可以将动脉剖开，沿着纵轴将动脉壁切成约长2mm宽１mm的长条形．注意，在取材时尽量使用锋利的刀片（最好用剃须刀），且不要挤压血管，由于血管内皮比较脆弱，容易受伤脱落．包埋时应作好定向包埋。

骨组织取材法

骨组织分布广，有的较硬，有的较软，骨组织因为无机物沉积较多（主要为钙盐的沉积）而较硬，必须经过脱钙处理（软骨组织可以不用脱钙）。

首先将骨组织切取一小片，大概1-2毫米大小，经过4%戊二醛固定2小时以上，再经生理盐水漂洗后放入脱钙液内进行脱钙，一般选择温和的EDTA脱钙液（具体配方可参考相关资料，这里不详细叙述）进行脱钙，也可利用酸类进行脱钙，脱钙时间视脱钙液不同而有差异，至于判断脱钙程度如何，可以使用镊子夹住骨片，轻轻将两端向中心压拢，感觉其弹性强度进而判断脱钙程度。脱钙完成后先经生理盐水漂洗后再用4%戊二醛固定2小时，然后按常规方法进行处理。

四、需要客户提供的材料：

1、按照标准方法取材固定的实验样本（固定在戊二醛固定液中的样品）。

2、透射电镜实验登记表，可将此资料电子版发送给对应的业务人员。

五、样本储存运输标准：

1、储存：样本取材后，4℃保存时间不超过1 个月。

2、运输：泡沫盒+冰袋的方式运输，样品用气泡膜包裹，避免标本瓶直接接触冰块，固定液加注至瓶体的九成满，切记使用上述带螺纹和铝箔垫片的样本瓶，以免邮寄途中液体渗出，并在瓶体标注好编号。

六、固定液配方

2.5﹪戊二醛固定液的配方：0.2M 磷酸缓冲液50ml，25﹪戊二醛溶液（电镜专用）10ml，加双蒸水至100ml，戊二醛溶液最终浓度为：2.5%，pH 值7.3-7.4

配比好的固定液一定要放入4℃冰箱低温冷藏。